免疫比(bi)濁反(fan)應過程常(chang)常(chang)為非線性(xing)過程反(fan)應，這就使得標(biao)準(zhun)(zhun)曲線的(de)線性(xing)擬合成為準(zhun)(zhun)確(que)(que)測定的(de)關(guan)鍵環(huan)節。準(zhun)(zhun)確(que)(que)的(de)線性(xing)擬合能夠提高檢測結果的(de)準(zhun)(zhun)確(que)(que)性(xing)，減少誤差，更好(hao)地(di)反(fan)映實際情況(kuang)。

1、免疫比濁反應的基本原理

免疫比濁法分為免疫透射比濁法和免疫散射比濁法。免疫透射比濁法中，Apo的特異抗體與血清中相應的抗原結合形成抗原 - 抗體免疫復合物，并形成微細顆粒，混懸于溶液介質中。光線通過這種渾濁介質溶液時被吸收一部分，吸收的多少與混濁顆粒的量成正比。在抗體量一定的條件下，抗原越多，抗原 - 抗體復合物越多，溶液越渾濁，吸收光越多，以此對抗原進行定量。該法是目前使用最為廣泛的方法，快速準確，可在自動生化分析儀上作批量檢測 。免疫散射比濁法是當光線通過含抗原 - 抗體復合物的渾濁介質溶液的混懸顆粒時，出現光散射作用，散射光強度與溶液中混懸顆粒的量成正比。該法的進行，需要有具備測定散射光的儀器如散射比濁儀等。

在免疫比濁反應中，由于抗(kang)原(yuan)與抗(kang)體結合的過程中，吸收度與濃度之間不呈線性關系，一般是三次程曲線關系。這一特性決定了在構建標準曲線時不能簡單地采用線性擬合方法。

2、標準曲線(xian)線(xian)性(xing)擬(ni)合的重要性(xing)

單點或兩點定標(biao)方(fang)式(shi)的局(ju)限性(xing)：采(cai)用單點或兩點定標(biao)方(fang)式(shi)，構成的標(biao)準曲線(xian)(xian)都(dou)是一條直線(xian)(xian)，與實(shi)際(ji)反應曲線(xian)(xian)有較(jiao)大不(bu)相符合，導致測定結果(guo)與實(shi)際(ji)值(zhi)偏(pian)差(cha)較(jiao)大。

多點(dian)(dian)定(ding)標(biao)(biao)的(de)優勢：采用多點(dian)(dian)定(ding)標(biao)(biao)方(fang)式，通過函數 - 對數線(xian)性擬合(he)，標(biao)(biao)準曲(qu)線(xian)為一3次(ci)方(fang)曲(qu)線(xian)，能較(jiao)好(hao)反應實際，測定(ding)結(jie)果準確性較(jiao)好(hao)。通過多點(dian)(dian)測量(liang)，可(ke)以更(geng)(geng)全面(mian)地涵蓋可(ke)能的(de)濃度范圍，捕捉到免疫比濁反應中的(de)非線(xian)性關(guan)系，從而(er)使(shi)擬合(he)出的(de)曲(qu)線(xian)更(geng)(geng)接近真實的(de)反應情況。

四、線性擬合的方法

數據采集：首先要確定合適的標準品濃度點。一般采用五點或七點不同濃度進行定標。這些濃度點應能覆蓋待檢測物質的臨床常見濃度范圍。對于每個標準品濃(nong)度，準確測量其在免疫比濁反應中的吸光度（透射比濁法）或散射光強度（散射比濁法）。測量過程中要確保實驗條件的一致性，包括溫度、反應時間、試劑的用量和質量等。

曲線擬合函數的選擇：由(you)于免(mian)疫比濁(zhuo)反應(ying)中吸收度(du)與濃度(du)之(zhi)間一般是(shi)三(san)次程(cheng)曲線(xian)(xian)關系，常采用這種函數(shu)形式能夠較(jiao)好地描述免(mian)疫比濁(zhuo)反應(ying)中的(de)非線(xian)(xian)性(xing)關系。在某些情(qing)況(kuang)下(xia)，也可以采用對數(shu)線(xian)(xian)性(xing)擬(ni)合(he)(he)(he)。即將數(shu)據進行對數(shu)轉換(huan)后再進行線(xian)(xian)性(xing)擬(ni)合(he)(he)(he)。例(li)如，對于一些濃度(du)范圍(wei)跨度(du)較(jiao)大的(de)數(shu)據，對數(shu)轉換(huan)可以將數(shu)據的(de)分布變得(de)更(geng)(geng)均勻，使擬(ni)合(he)(he)(he)效(xiao)果更(geng)(geng)好。三(san)次曲線(xian)(xian)方程(cheng)，通過解方程(cheng)組的(de)方式求出方程(cheng)的(de)系數(shu)，從而(er)得(de)到(dao)擬(ni)合(he)(he)(he)曲線(xian)(xian)。

五、線性擬合技巧

樣本處理的一致性：在采集樣本和進行免疫比濁反應時，要確保所有樣本的處理方式相同。包括樣本的采集方法、保存條件、離心速度和時間等。

儀器的校準與維護：對于免疫(yi)透(tou)射(she)比濁(zhuo)法(fa)使用的(de)分光光度計或免疫(yi)散(san)射(she)比濁(zhuo)法(fa)使用的(de)散(san)射(she)比濁(zhuo)儀等儀器(qi)，要(yao)定期(qi)進行校準。校準過(guo)程中要(yao)使用標準的(de)校準物，確保儀器(qi)的(de)波(bo)長準確性(xing)(xing)、吸光度或散(san)射(she)光強(qiang)度測量的(de)準確性(xing)(xing)等。

排除干擾因素：免疫(yi)比(bi)濁(zhuo)反應(ying)可(ke)(ke)能(neng)會(hui)受(shou)到(dao)多種(zhong)因素的干(gan)擾(rao)(rao)，如(ru)脂(zhi)(zhi)血、黃(huang)疸、內源性干(gan)擾(rao)(rao)物(wu)(wu)質(zhi)（RF、嗜異性抗(kang)(kang)體、人抗(kang)(kang)動物(wu)(wu)抗(kang)(kang)體、自身抗(kang)(kang)體、M蛋白等）、鉤狀效應(ying)等。對(dui)(dui)于脂(zhi)(zhi)血樣(yang)本，由于其中含有大量(liang)乳糜顆粒，具(ju)有光散(san)射(she)的特性，會(hui)產生濁(zhuo)度干(gan)擾(rao)(rao)。可(ke)(ke)以(yi)采用(yong)一(yi)些(xie)特殊的處理(li)方法(fa)，如(ru)超速離(li)心去除(chu)乳糜顆粒，或者采用(yong)校正算法(fa)來(lai)(lai)(lai)消(xiao)除(chu)其對(dui)(dui)測(ce)量(liang)結果(guo)的影響(xiang)。對(dui)(dui)于黃(huang)疸樣(yang)本，膽(dan)紅素及其衍生物(wu)(wu)在(zai)特定波長(chang)下產生的本底干(gan)擾(rao)(rao)，可(ke)(ke)以(yi)通過選擇(ze)合適(shi)的檢測(ce)波長(chang)或者對(dui)(dui)樣(yang)本進行預(yu)處理(li)來(lai)(lai)(lai)降低干(gan)擾(rao)(rao)。對(dui)(dui)于內源性干(gan)擾(rao)(rao)物(wu)(wu)質(zhi)，可(ke)(ke)以(yi)采用(yong)封閉試劑或優(you)化實驗體系等方法(fa)來(lai)(lai)(lai)減少(shao)其對(dui)(dui)免疫(yi)比(bi)濁(zhuo)反應(ying)的影響(xiang)。

驗證擬合曲線的有效性：在構建好標準曲線后，使用一組獨立的外部驗證樣本對擬合曲線的有效性進行驗證。這些驗證樣本的濃度應涵蓋標準曲線的濃度范圍，且與構建標準曲線的樣本無交叉。將驗證樣本的測量值代入擬合曲(qu)線方程計算出預測濃度，然后與已知的真實濃度進行比較，計算誤差率。如果誤差率在可接受范圍內（如小于[具體誤差率數值]），則說明擬合曲線有效。也可以采用內部交叉驗證的方法，將樣本數據分成若干組，輪流用其中一組作為驗證集，其余組作為訓練集構建標準曲線，然后對驗證集進行預測并評估誤差，通過多次交叉驗證來評估擬合曲線的穩定性和準確性。